IDENTIFICACION DEL GENERO CLOSTRIDIUM

Cultivo. La mayoría crecen sólo en condiciones de anaerobiosis. El uso de medios

enriquecidos proporciona condiciones óptimas para el crecimiento. Entre los suplementos más comúnmente empleados están: el extracto de levadura, sangre, hemina, vitamina K y algunos aminoácidos.

Los mejores medios para la recuperación de microorganismos anaerobios son aquellos

que nunca han sido expuestos al oxígeno, es decir, medios recién preparados (frescos) o prerreducidos, esterilizados anaeróbicamente, eliminando el oxígeno y reduciendo de modo parcial los ingredientes mediante ebullición o añadiendo agentes reductores. La preparación de medios anaerobios es impracticable por la mayoría de los laboratorios, sin embargo, existen sistemas anaeróbicos comercialmente disponibles.

Las muestras recomendadas para cultivo anaerobio deben ser inoculadas en placas con medio agar-sangre no selectivo (Columbia, Brucella, BHI, TSB), medio anaerobio selectivo agar-sangre-feniletil-alcohol, agar-sangre-vancomicina-kanamicina) y medio líquido de enriquecimiento (tioglicolato y glucosa-carne molida). Los medios líquidos deben ser calentados durante 10 minutos antes de ser inoculados.

Tanto el medio selectivo como el no selectivo deben ser empleados en el aislamiento primario. El medio de enriquecimiento servirá para el control del cultivo primario en placas, para recuperar microorganismos que hayan crecido en bajo número y para el aislamiento de organismos de crecimiento lento. La selección de los diversos medios varía con la procedencia y la naturaleza de la muestra.

Procedimientos de inoculación

Muestras líquidas: deberá emplearse una pipeta capilar (o directamente de la jeringuilla donde se colectó la muestra) para inocular el medio líquido o semisólido. Se evitará la agitación, ya que puede airearse de nuevo el medio. Se colocarán una o dos gotas del inóculo en cada medio en placa, estriándolo con un asa bacteriológica que no sea de níquel y cromo (nicrom), ya que este oxida el inóculo. Deberá realizarse, además, un frotis para coloración de Gram antes de descartar la pipeta o la jeringuilla.

Tejido y otros especímenes: la muestra se homogeneizará en 1 mL de caldo tioglicolato u otro medio apropiad utilizando un mortero. Este procedimiento debe realizarse en una cámara de anaerobiosis para minimizar la exposición al oxígeno, de lo contrario, se procederá lo más rápidamente posible. Una vez obtenida la homogeneización, se procederá de igual forma que con muestras líquidas.

Hisopados: si se reciben dos hisopos, uno deberá emplearse para inocular el medio líquido, rotándolo suavemente para evitar agitación y el otro se utilizará en un frotis para coloración de Gram. Si se dispone sólo de un hisopo, se preparará una suspensión en 0,5 o 1,0 mL de tioglicolato u otro medio adecuado, para luego proceder de igual forma que con las muestras líquidas.

Forma de las colonias. Algunos microorganismos producen colonias grandes, elevadas, con bordes enteros en medios sólidos (C. perfringens); otros producen colonias más pequeñas, cuyos bordes se extienden en forma de red de finos filamentos (C. tetani). Muchos clostridios producen una zona de hemólisis en agar-sangre y de manera típica, C. perfringens crea una doble β-hemólisis alrededor de sus colonias.

Se recomienda, generalmente, que los cultivos en condiciones anaeróbicas deben incubarse durante 48 horas, para evitar las exposiciones bactericidas al oxígeno durante las observaciones a las 24 horas. Es asimismo recomendable hacer coloración de Gram a cada tipo de colonia aislada, para observar la presencia de esporas.

Características del crecimiento. Teniendo en cuenta que los clostridios tienen características culturales similares, a la vez que pueden confundirse con especies facultativas del género Bacillus spp., debe realizarse el test de aerotolerancia (relación con el oxígeno), que consiste en subcultivar cada colonia en medio agar-sangre (incubado anaeróbicamente), en medio agar-chocolate (incubado en 5 % de CO2) y del mismo hisopo, depositar una porción del material en una lámina portaobjeto para coloración de Gram. La prueba de catalasa puede servir para la diferenciación con los miembros facultativos del género Bacillus spp. La placa de agar-sangre para anaerobiosis puede ser estriada para colocarle discos de kanamicina, colistina y vancomicina como parte de la identificación presuntiva de especies de clostridios.

La identificación de C. tetani y C. botulinum no se lleva a cabo en laboratorios de diagnóstico. El diagnóstico habitual del tétanos es clínico, mientras que el botulismo se diagnostica en laboratorios de referencia.

PROCEDIMIENTOS ESPECIALES PARA AISLAMIENTO

DE CLOSTRIDIOS

Sistemas anaeróbicos

Dado que la incubación de los anaerobios debe llevarse a cabo en ausencia de aire, se han diseñado diversos métodos para lograrlo. Se dispone en la actualidad de jarras, cámaras, bolsas anaeróbicas, así como del método del tubo revestido con medio sólido prerreducido (roll tube method).

Las primeras jarras anaeróbicas lograban estas condiciones gracias al empleo de catalizadores (para acelerar la unión del H2 con el O2 con producción de agua) activados mediante corriente eléctrica. Las jarras anaeróbicas producidas hoy, como el sistema GasPack Jar (Becton Dickinson) o el Oxoid Jar (Oxoid), son mucho más prácticas, pues utilizan sistemas de catalizadores "fríos" que no requieren calor ni corriente eléctrica, tales como los pellets de aluminio recubiertos con paladio (que deben ser reactivados a 160 °C durante 2 horas después de cada uso, para evitar la humedad y la acumulación de H2S). Las condiciones de anaerobiosis pueden lograrse con generadores desechables de hidrógeno-dióxido de carbono, consistentes en tabletas de ácido cítrico-bicarbonato de sodio y de borohidruro de sodio-cloruro de cobalto. El sistema se activa añadiendo 10 mL de agua con una pipeta a la bolsa que contiene las tabletas. Se colocan toallas de papel para evitar el exceso de humedad dentro de la jarra. La reacción responsable de crear las condiciones de anaerobiosis es la siguiente:

1. C6H8O7 + 3 NaHCO3 Na3 (C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2

2. NaBH4 + 2 H2O NaBO2 + 4 H2

Bacillus... [bacterias productoras de toxinas]

Bacillus.

El género Bacillus está compuesto por bacilos grampositivos grandes caracterizados por su capacidad para producir endosporas. El género incluye microorganismos aerobios estrictos y anaerobios facultativos. Bacillus anthracis es causante de enfermedad en el ser humano. Muchas otras especies están distribuidas en la naturaleza y se hallan en la mayor parte de las muestras de suelos, agua y polvo. Ciertos miembros de dicho género han adquirido importancia como productores de antibióticos.

Bacillus anthracis.

Ántrax o carbunco (enfermedad de los animales herbívoros, ovinos y bovinos, equinos, porcinos y caprinos) es causado por el B. anthacis, un bacilo grampositivo aerobio y formador de esporas. Es un bacilo recto que mide de 3 a 5 micras de largo y de 1 a 1.2 micras de ancho, es inmóvil. Están encapsulados durante la proliferación en el animal infectado.

Resistencia.

Debido a su capacidad para producir esporas, el bacilo del carbunco es sumamente resistente a los ambientes químicos y físicos adversos. Una temperatura de 120oC durante 15 min puede inactivar a las esporas. Las esporas permanecen viables durante años en las pasturas contaminadas.

Determinantes de la patogenicidad.

La patogenia del B. anthracis depende de dos factores de virulencia importantes: una cápsula poli (ácido D-glutámico) y una exotoxina. La cápsula interfiere en la fagocitosis. Los efectos letales se deben a una exotoxina que consiste en tres proteínas características y serológivamente activas: el antígenos protector (PA), el factor de edema (EF) y el factor letal (LF).

Epidemiología.

La incidencia del carbunco en el hombre es baja. En la actualidad casi todos los casos ocurren en personas no vacunadas que trabajan en las hilanderías y en lugares donde se trabaja con fieltro.

Patogenia.

Los seres humanos se infectan de una de tres formas:

1. La vía cutánea. Los microorganismos acceden a través de pequeñas abrasiones o cortes y se multiplican.
2. Inhalación. Los microorganismos son inhalados, se multiplican en los pulmones y son barridos hacia los ganglios linfáticos hiliares de drenaje, donde se rpoduce una necrosis hemorrágica.
3. Ingestión. Rara vez los microorganismos son ingeridos en carne infectada, con ella resultante invasión y ulceración de la mucosa gastrointestinal.

El ántrax humano tiene tres formas clínicas: cutánea, por inhalación, y gastrointestinal.

El ántrax cutáneo resulta de la introducción de la espora a través de la piel; el ántrax de la inhalación es a través del tracto respiratorio, y el ántrax gastrointestinal por ingestión.

En el cutáneo primero se produce picor superficial en la zona donde se produce la penetración, seguido por una lesión que se vuelve papular, después vesicular y en 2-6 días desarrolla un chancro negro deprimido. El chancro normalmente se rodea por un edema de moderado a severo y muy extenso, a veces con vesículas secundarias pequeñas.

Las infecciones no tratadas pueden extenderse a los nodos de la linfa regionales y al torrente sanguíneo con una septicemia aplastante. El ántrax cutáneo no tratado tiene una proporción de muertes entre el 5% y el 20%, pero con terapia antibiótica eficaz, ocurren pocas muertes.

Los síntomas iniciales del ántrax por inhalación son apacibles y no específicos y pueden incluir fiebre, malestar y tos apacible o dolor del pecho; los síntomas agudos de dolor respiratorio, fiebre y shock aparecen en 3-5 días, produciéndose la muerte rápidamente después de esto.

El ántrax pulmonar se adquiere inhalando esporas del bacilo que son lo suficientemente pequeñas como para penetrar muy adentro en los pulmones, aparece después de la rápida multiplicación de las esporas en los ganglios linfáticos del mediastino. Se desarrolla una linfadenitis hemorrágica necrosante severa que se extiende por las estructuras mediastínicas adyacentes. Hay trasudado serosanguinolento, edema pulmonar y derrame pleural. Los síntomas iniciales son insidiosos . Al principio, la enfermedad tiene síntomas parecidos a los de una gripe severa: tos, dolor muscular, de cabeza y de pecho; luego la enfermedad se torna más severa, hasta producir un estado de shock en el cual muere el 95% de los afectados. La radiografía de tórax muestra una infiltración difusa en placas; el mediastino se encuentra ensanchado a causa de las adenomegalias hemorrágicas. La enfermedad sólo puede controlarse si se empieza un tratamiento drástico con antibióticos dentro de las primeras 48 horas de iniciarse los síntomas. Sin embargo, debido a que en sus primeras etapas la enfermedad es difícil de diagnosticar, generalmente los afectados pocas veces reciben el tratamiento oportuno.

El ántrax intestinal es raro y más difícil reconocer.

La confirmación de laboratorio se hace por aislamiento de B. anthracis de la sangre, lesiones superficiales, o las secreciones respiratorias mediante tinción con azul de metileno (M'Fadyean), o por cultivo o inoculación en ratones, o conejos. Se puede realizar la identificación rápida del organismo por immunodiagnóstico, ELISA y PCR.

Características de su cultivo.

Proliferan bien en placas con agar sangre. La proliferación máxima se obtiene con un pH de 7-7.4 en condiciones aerobias, pero se produce desarrollo en ausencia de oxígeno.

Identificación de laboratorio.

Ni los aspectos morfológicos ni las características de cultivo habituales permiten diferenciar al B. anthracis de las cepas inmóviles de B. cereus, el microorganismo con el que más fácilmente se confunde. Sin embargo, las cepas virulentas de B. anthracis son los únicos microorganismos que producen colonias rugosas cuando proliferan en ausencia de un mayor nivel de CO2 y colonias mucoides cuando proliferan en un medio con bicarbonato de sodio en una atmósfera con un 5% de CO2.

Bacillus cereus.

Es una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia. Tiene una morfología celular similar a la del B. anthracis pero a diferencia de éste en general es móvil y no es susceptible a la penicilina o al gama-fago.

La intoxicación alimentaria por B. cereus puede causar dos síncromes clínicos:

1. tiene un periodo de incubación breve de cuatro horas. Se caracteriza por náuseas y vómitos severos y con frecuencia se confunde con la intoxicación alimentaria estafilocócica.
2. tiene un periodo de incubación más prolongado (17 hrs) y se caractería por cólicos abdominales y diarrea.
3. Habitualmente se confunde con la intoxicación alimentaria por clostridios.

CARACTERISTICAS

• Son bacterias Gram positivas, familia bacillaceae
• Aerobio y anaerobio facultativo
• Esporulado: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta.
• Crecen entre los 10 - 48º, la temperatura óptima es entre 28 - 35º.
• Generalmente son móviles con flagelos perítricos.
• Poseen antígenos somáticos y flagelares y de esporas.
• Las reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan reacciones cruzadas con otros géneros.
• Los antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias esporas
• pH = 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95.
• Para la germinación en el momento que se agota el medio, al final de la fase exponencial ocurre la esporulación porque son menos exigentes. La germinación de las esporas es a 30º. Las esporas son moderadamente resistentes al calor. Resisten 100º durante 5-10 minutos.

ENZIMAS Y TOXINAS QUE PRODUCE B. CEREUS

Lecitinasa (fosfolipasa), se puede detectar porque estos microorganismos dan lugar a una reacción típica de precipitación cuando crecen en medios con yema de huevo. Es una sustancia que puede estar relacionada con efectos necróticos de células intestinales.

Hemolisina, produce la lisis de glóbulos rojos

Factor letal, produce la muerte de conejos cuando se inyectan por vía endovenosa

Factor de permeabilidad vascular, produce alteraciones en vasos sanguineos ya que altera su permeabilidad.

Toxina necrótica, relacionada con la lecitina y produce necrosis de las células del epitelio intestinal

Toxina emética, produce vomitos. Toxina estable a 126º durante 90 minutos. Estable a pH 2 y 11 durante 2 horas, puede sobrevivir en los alimentos.

Factor del asa ileal de conejo, origina diarrea y salida de líquido en experimentación.

Todas esta sustancias se producen a lo largo de la fase exponencial o al final de la misma por las células vegetativas

HABITAT Y EPIDEMIOLOGIA

• Es ubicuo
• Se puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e industrializados
• Cuando se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica aparente
• Se empezo a asociar a alimentos en los años 50.
• En los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados pero si se dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas, conviene enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración.
• En la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no son esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la posterior germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser detectado.
• Alimentos que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras, sopas, salsas, ensaladas, arroz hervido.

PODER PATOGENO

• Toxina hemética, enterotoxina, la parte activa es una sustancia de bajo peso molecular (10.000), es estable al calor (resiste 120º durante 1 hora)
• Factor del asa ileal de conejo, enterotoxina diarreica, proteina de peso molecular 38000-50000, se inactiva por calentamiento a 56º durante 5 minutos, es termolábil.

CUADRO CLINICO

Síndrome emético, nauseas y vomitos se producen al cabo de 1-5 horas, la diarrea no es tan frecuente.

Síndrome diarreico, período de incubación de 8 a 10 horas, dolor abdominal y diarrea, la clínica desaparece a las 12-24 horas.

Cultivo

Las colonias aparecen rodeadas de un halo de precipitación blanco sobre fondo rosa-rojo-violeta, las que fermentan el manitol de color amarillo, a las 24 horas las colonias son circulares y lisas, a las 48 horas grandes y rugosas con estrías, nº de colonias x factor de dilución = nº U.F.C. / g.

Las colonias sospechosas se trnasfieren a un agar nutritivo y se incuba.

Sembramos en agar para anaerobios sin glucosa ni indicador, sembramos en picadura, se añade parafina, incubamos a 31º 24 hora, si hay crecimiento es Bacillus cereus.

Caldo glucosa sin fosfato, prueba de Voges Proskaguer (VP+), detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y añadir cristales de creatina para que la reacción sea más rápida.

Agar nutritivo glucosa, incubar a 31º 24-48 horas, se realiza la tinción con fuschina y el polihidroxibutirato (material de reserva) no se tiñe.

Caldo nitrato, la prueba es positiva si hay transformación del nitrato en nitrito.

Movilidad, se siembra en agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo es movil crece por todo el medio.

Se puede calcular el NMP cuando se sospecha que el alimento tenga menos de 10 UFC/ml. A partir de diluciones decimáles se siembran en: caldo tripticasa a 31º durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se confirma.

PREVENCION Y CONTROL

• Evitar que se multipliquen en los alimentos
• Cocinar los alimentos antes de servirlos
• Enfriarlos rapidamente y refrigerar
• Control en los platos preparados