IDENTIFICACION DEL GENERO CLOSTRIDIUM

Cultivo. La mayoría crecen sólo en condiciones de anaerobiosis. El uso de medios

enriquecidos proporciona condiciones óptimas para el crecimiento. Entre los suplementos más comúnmente empleados están: el extracto de levadura, sangre, hemina, vitamina K y algunos aminoácidos.

Los mejores medios para la recuperación de microorganismos anaerobios son aquellos

que nunca han sido expuestos al oxígeno, es decir, medios recién preparados (frescos) o prerreducidos, esterilizados anaeróbicamente, eliminando el oxígeno y reduciendo de modo parcial los ingredientes mediante ebullición o añadiendo agentes reductores. La preparación de medios anaerobios es impracticable por la mayoría de los laboratorios, sin embargo, existen sistemas anaeróbicos comercialmente disponibles.

Las muestras recomendadas para cultivo anaerobio deben ser inoculadas en placas con medio agar-sangre no selectivo (Columbia, Brucella, BHI, TSB), medio anaerobio selectivo agar-sangre-feniletil-alcohol, agar-sangre-vancomicina-kanamicina) y medio líquido de enriquecimiento (tioglicolato y glucosa-carne molida). Los medios líquidos deben ser calentados durante 10 minutos antes de ser inoculados.

Tanto el medio selectivo como el no selectivo deben ser empleados en el aislamiento primario. El medio de enriquecimiento servirá para el control del cultivo primario en placas, para recuperar microorganismos que hayan crecido en bajo número y para el aislamiento de organismos de crecimiento lento. La selección de los diversos medios varía con la procedencia y la naturaleza de la muestra.

Procedimientos de inoculación

Muestras líquidas: deberá emplearse una pipeta capilar (o directamente de la jeringuilla donde se colectó la muestra) para inocular el medio líquido o semisólido. Se evitará la agitación, ya que puede airearse de nuevo el medio. Se colocarán una o dos gotas del inóculo en cada medio en placa, estriándolo con un asa bacteriológica que no sea de níquel y cromo (nicrom), ya que este oxida el inóculo. Deberá realizarse, además, un frotis para coloración de Gram antes de descartar la pipeta o la jeringuilla.

Tejido y otros especímenes: la muestra se homogeneizará en 1 mL de caldo tioglicolato u otro medio apropiad utilizando un mortero. Este procedimiento debe realizarse en una cámara de anaerobiosis para minimizar la exposición al oxígeno, de lo contrario, se procederá lo más rápidamente posible. Una vez obtenida la homogeneización, se procederá de igual forma que con muestras líquidas.

Hisopados: si se reciben dos hisopos, uno deberá emplearse para inocular el medio líquido, rotándolo suavemente para evitar agitación y el otro se utilizará en un frotis para coloración de Gram. Si se dispone sólo de un hisopo, se preparará una suspensión en 0,5 o 1,0 mL de tioglicolato u otro medio adecuado, para luego proceder de igual forma que con las muestras líquidas.

Forma de las colonias. Algunos microorganismos producen colonias grandes, elevadas, con bordes enteros en medios sólidos (C. perfringens); otros producen colonias más pequeñas, cuyos bordes se extienden en forma de red de finos filamentos (C. tetani). Muchos clostridios producen una zona de hemólisis en agar-sangre y de manera típica, C. perfringens crea una doble β-hemólisis alrededor de sus colonias.

Se recomienda, generalmente, que los cultivos en condiciones anaeróbicas deben incubarse durante 48 horas, para evitar las exposiciones bactericidas al oxígeno durante las observaciones a las 24 horas. Es asimismo recomendable hacer coloración de Gram a cada tipo de colonia aislada, para observar la presencia de esporas.

Características del crecimiento. Teniendo en cuenta que los clostridios tienen características culturales similares, a la vez que pueden confundirse con especies facultativas del género Bacillus spp., debe realizarse el test de aerotolerancia (relación con el oxígeno), que consiste en subcultivar cada colonia en medio agar-sangre (incubado anaeróbicamente), en medio agar-chocolate (incubado en 5 % de CO2) y del mismo hisopo, depositar una porción del material en una lámina portaobjeto para coloración de Gram. La prueba de catalasa puede servir para la diferenciación con los miembros facultativos del género Bacillus spp. La placa de agar-sangre para anaerobiosis puede ser estriada para colocarle discos de kanamicina, colistina y vancomicina como parte de la identificación presuntiva de especies de clostridios.

La identificación de C. tetani y C. botulinum no se lleva a cabo en laboratorios de diagnóstico. El diagnóstico habitual del tétanos es clínico, mientras que el botulismo se diagnostica en laboratorios de referencia.

PROCEDIMIENTOS ESPECIALES PARA AISLAMIENTO

DE CLOSTRIDIOS

Sistemas anaeróbicos

Dado que la incubación de los anaerobios debe llevarse a cabo en ausencia de aire, se han diseñado diversos métodos para lograrlo. Se dispone en la actualidad de jarras, cámaras, bolsas anaeróbicas, así como del método del tubo revestido con medio sólido prerreducido (roll tube method).

Las primeras jarras anaeróbicas lograban estas condiciones gracias al empleo de catalizadores (para acelerar la unión del H2 con el O2 con producción de agua) activados mediante corriente eléctrica. Las jarras anaeróbicas producidas hoy, como el sistema GasPack Jar (Becton Dickinson) o el Oxoid Jar (Oxoid), son mucho más prácticas, pues utilizan sistemas de catalizadores "fríos" que no requieren calor ni corriente eléctrica, tales como los pellets de aluminio recubiertos con paladio (que deben ser reactivados a 160 °C durante 2 horas después de cada uso, para evitar la humedad y la acumulación de H2S). Las condiciones de anaerobiosis pueden lograrse con generadores desechables de hidrógeno-dióxido de carbono, consistentes en tabletas de ácido cítrico-bicarbonato de sodio y de borohidruro de sodio-cloruro de cobalto. El sistema se activa añadiendo 10 mL de agua con una pipeta a la bolsa que contiene las tabletas. Se colocan toallas de papel para evitar el exceso de humedad dentro de la jarra. La reacción responsable de crear las condiciones de anaerobiosis es la siguiente:

1. C6H8O7 + 3 NaHCO3 Na3 (C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2

2. NaBH4 + 2 H2O NaBO2 + 4 H2